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恒遠生物|酶的提取、分離、活力檢測與純化

更新時(shí)間:2024-06-19 點(diǎn)擊量:59

一、實(shí)驗目的


酶是植物體內具有催化作用的蛋白質(zhì),植物體內的生化反應一般都在酶的作用下進(jìn)行,沒(méi)有酶的催化反應,植物生命也就停止了,因此對酶的研究是闡明生命現象本質(zhì)中十分重要的部分。研究酶先要將酶從組織中提取出來(lái),加以分離、純化,不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不同,有些工作只需粗的酶制劑即可,而有些工作則要求較純的酶制劑,根據不同情況區別對待。在酶的提取和純化過(guò)程中,自始至終都需要測定酶的活性,通過(guò)酶活性的測定以監測酶的去向。


二、實(shí)驗原理


(1)酶的提取


1.酶存在于動(dòng)植物以及微生物的細胞的各個(gè)部位。


2.酶如何從細胞中分離


??從高等植物中提取酶常遇到一些實(shí)際問(wèn)題,先是細胞中含有許多種酶,每種酶的濃度又很低,只占細胞總蛋白質(zhì)中的小部分(葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外),而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外,各種酶的存在狀態(tài)不同,有外酶、內酶,內酶中有與細胞器一定結構相結合的結合酶,也有的存在于細胞質(zhì)中,提取時(shí)都應區別對待,作不同處理。如果酶僅存在于細胞質(zhì)中,只要將細胞破碎,酶就會(huì )轉移到提取液中;但如果是與細胞器(如細胞壁、細胞核、線(xiàn)粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等)緊密結合的酶,這時(shí)僅破碎細胞還不夠,還需用適當的方法將酶從這些結構上溶解下來(lái)。其次,細胞中存在抑制物質(zhì),如酚,酸,離子等,它們通常在液泡中,當細胞破碎時(shí),這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細胞中釋放出來(lái),進(jìn)入提取液中,特別是酚類(lèi)物質(zhì),具有游離的酚羥基,能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強的氫鍵,不能為一般的實(shí)驗方法,如透析和凝膠過(guò)濾所解離。如果沒(méi)有特殊需要,一般選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗,在這些組織中一般酚類(lèi)化合物含量較低。在提取過(guò)程中為了盡量減少酚類(lèi)的影響,一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液,在高pH值時(shí),酚類(lèi)大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強的氫鍵,但高pH值促進(jìn)酚類(lèi)氧化,同時(shí)降低酚類(lèi)吸附劑(如PVP)的有效性,通常采用pH6.7梍7.2。PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復合物,是酚類(lèi)化合物的有效結合劑。在提取線(xiàn)粒體時(shí)加入可溶性PVP,提取可溶性酶時(shí)加入不溶性交聯(lián)PVP,能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體,可加10% HCl煮沸10分鐘,用NaOH中和,再用水洗幾次,直至中性,純化后的PVPP可直接應用。


植物細胞有堅韌的細胞壁,需要強烈的方法去破碎,少量樣品可用研缽加石英砂研磨,或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動(dòng)勻漿器。為減低研磨或勻漿過(guò)程中發(fā)熱,所用器皿和溶液需要預冷,提取液的用量一般為組織的1梍5倍,用量大些有利于提高得率,但工作量大。提取勻漿時(shí)加入酚類(lèi)結合劑PVPP,金屬螯合劑Na2─EDTA,以及─SH化合物以保護蛋白質(zhì),或加入非離子型去垢劑如Triton X─100,以增加蛋白質(zhì)的可溶度,常用于與膜脂結合的酶。(可以通過(guò)試驗以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。)


(2)離和純化


1.上面制備得到的提取液中,除含有所需要的酶外,還含有其他蛋白質(zhì),以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。


2.如何將酶從粗提液中分離純化


要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白,目前常用的方法有鹽析法,往層析法,薄膜超濾法,親和層析法,電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一,在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性,利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低,鹽析法就是利用這一性質(zhì),將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離,選擇合適飽和度的硫酸銨,使沉淀的蛋白質(zhì)酶活性最大。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集,再溶于少量緩沖溶液中,經(jīng)透析或凝膠柱過(guò)濾,以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì),再經(jīng)過(guò)柱層析分離。由于吸附劑的不同,又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同,分子篩類(lèi)型凝膠過(guò)濾柱層析,洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了。對于吸附柱和離子交換柱層析,往往要采用濃度梯度溶液進(jìn)行洗脫,最-方便的是線(xiàn)性梯度濃度,當然用非線(xiàn)性梯度會(huì )得到更好的分離效果。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣,已成為常規酶的分離提純步驟之一。


??近年來(lái)純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結合能力,這一性質(zhì)即可用來(lái)分離、提純酶。先選擇支持物,如瓊脂糖將底物、競爭性抑制劑或輔酶,以共價(jià)鍵的形式連接到支持物上,然后把含有酶的溶液,流過(guò)裝有專(zhuān)一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱,酶即被保留在支持物上,再充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì),然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液,進(jìn)行競爭性洗脫。(親和劑選擇合適,能得到較高純度的酶,是酶分離、純化中既方便又有效的一種方法。)


(3)酶活力的測定


酶的活力表現為催化某一反應的速度,反應速度越大,酶的活力也越大,酶催化的反應速度可以用單位時(shí)間內底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來(lái)表示。由于酶的催化作用和周?chē)h(huán)境的關(guān)系十分密切,環(huán)境的溫度、pH、離子強度等都對酶的活力有很大的影響,因此測定酶活力時(shí)應該使這些條件保持恒定。


酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量(或生成的產(chǎn)物量)μmol數表示。測定酶活性的方法很多,常因反應的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同選用不同的方法,應用最-廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應系統中的化合物在紫外區或可見(jiàn)光區有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測定。如果催化的反應系統中需要ATP或產(chǎn)生ATP,如一些激酶;或是有NAD存在,如一些脫氫酶和氧化還原酶;或反應產(chǎn)生H2O2,如一些氧化酶,這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測定。測定酶活性的方法很多,應根據具體情況選擇合適的方法。

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